Áramlási citometria a klinikai patológiában

Az 1960-as évek végén kifejlesztett áramlási citometriát először a humán immundeficiencia (HIV) vírus vizsgálatára alkalmazták az 1980-as évek elején. A szerzett immunhiányos szindróma diagnosztikáját segítette, még mielőtt a HIV-et azonosították volna. Az áramlási citometria alapjaiban változtatta meg a klinikai patológia gyakorlatát és forradalmasította a hematológiai és immunológiai diagnosztikát.

Az áramlási citometria segítségével betegségspecifikus markereket lehet kimutatni. A sokféle, fluoreszcensen jelölt antitest alkalmazása lehetőséget teremt arra, hogy meghatározzuk a kóros sejtek sejtfelszíni és egyéb markereinek a mintázatát és az expresszió mértékét. Ezek a markerek nem korlátozódnak pusztán a „felszíni” antigének kimutatására; citoplazmatikus és nukleáris antigének is vizsgálhatók a technikával, fontos kvalitatív, kvantitatív és funkcionális információkat biztosítva.

Az áramlási citometria egyre nagyobb elfogadást nyer a patológiai gyakorlatban. Előnye, hogy viszonylag könnyen kivitelezhető, és nagyszámú sejt vagy „esemény” kimutatására alkalmas. Az egyéb technológiákkal szemben a módszer egyedülálló tulajdonsága, hogy többféle paraméter alapján több tíz- vagy százezer sejt fenotípusa határozható meg másodpercenként.

A leukaemia diagnosztikája

A leukaemia a vérképzőrendszer sejtjeinek malignus proliferációja, mely két fő csoportra, krónikus és akut leukaemiára osztható. Ez egyben a prognózist is jelzi: az akut leukaemia túlélése kezelés nélkül viszonylag rövid, míg a krónikus leukaemiában szenvedő betegek kezelés nélkül is hosszabban túlélnek. Miközben a sejtek morfológiai megjelenése utalhat a prognózisra, a leukaemia típusának meghatározása a sejtek immunfenotipizálását és típusának besorolását igényli. Az antitest-panel reaktivitásának mintázata segítséget nyújthat a sejttípus és a differenciáltsági stádium azonosításához. A leukaemia típusának ismeretében megválasztható az optimális terápia és felbecsülhető a betegség prognózisa is.

Az immunhiány diagnosztikája

Az immundeficiencia a gazdaszervezet azon képességének gyengülése, melynek segítségével képes kivédeni a rekurrens fertőzések kialakulását. A defektus lehet primer (azaz örökletes) vagy szekunder (más patológiák következtében kialakuló). A humorális és a celluláris immunrendszer egyaránt érintett lehet. A primer immunhiány rendkívül ritka (körülbelül 10000 élveszületésre jut 1 ilyen eset). A szekunder immunhiány gyakoribb, oka lehet limforetikuláris malignitás, bizonyos gyógyszerek, vírusok, táplálkozási hiányállapotok vagy fehérjevesztés. Az immundeficiencia kivizsgálásának irányát a klinikai kép és az infektív kórtörténet szabja meg.

A celluláris immunrendszer defektusa lehet numerikus vagy funkcionális. A fő defektus a neutrophil sejtek és a lymphocyták területén mutatkozik meg. A neutrophil sejtek és lymphocyták számát a teljes vérkép részeként meghatározzák, és amennyiben az érték a normálisnál kisebb, úgy ez immunhiány gyanúját veti fel. A teljes lymphocyta-szám meghatározása nem elégséges az immundeficiencia kivizsgálásához, mivel az önálló lymphocyta-alcsoportok (T-sejtek, B-sejtek, NK-sejtek) izolált hiánya is okozhat immunhiányt. A lymphocyták alcsoportjai áramlási citometriával vizsgálhatók. Fontos, hogy a százalékos arány helyett a sejtek abszolút számát kell megadni, és a kapott értékeket össze kell hasonlítani az életkori referenciaértékekkel, mivel mind a teljes lymphocyta-szám, mind a lymphocyta-altípusok száma széles határok között változhat az életkor függvényében, különösen gyermekkorban.

Ritka defektusok gyanúját felveti, ha a neutrophil sejtek és a lymphocyták száma normális, ugyanakkor a sejtek funkcionális defektusokat mutatnak. Egy sor funkcionális teszt áll rendelkezésre a különböző immunsejtek vizsgálatára, melyek némelyike az áramlási citometria elvén nyugszik.

A B-sejtek defektusai antitesthiány klinikai képét hozhatják létre. A T-sejt-defektusok súlyossága a teljes T-sejt-hiánytól adott T-sejt-altípus numerikus defektusáig terjedhet, ilyen lehet például a CD4+ T-helper sejtek defektusa HIV-fertőzésben. A primer immundeficiencia azon eseteiben, ahol a T-sejtek hiányoznak, alacsony vagy funkcionálisan defektív alacsony immunglobilunszint lehet mérhető.

A monoklonális antitestterápiára adott válasz előrejelzése

A humanizált monoklonális antitesteket terápiás célra fejlesztették ki. Széles körben kerülnek klinikai alkalmazásra. Ezen antitestek arányát a terápiás protokoll részeként veszik figyelembe a hematológiai malignitások kezelésében. Ide tartozik a rituximab, a gemtuzumab és az alemtuzumab. Az antitestek a ráksejteken lévő e fehérjéket veszik célba, és a sejtekhez való kötődésüket követően az immunrendszer eltávolítja azokat (immunterápia). A monoklonális antitestekkel végzett kezelés költséges, ezért bevett gyakorlat, hogy a terápia megkezdése előtt ellenőrzik a célmolekulák jelenlétét a tumorsejteken.

A ritka események kimutatása

A modern áramlási citométerek akár 100000 sejt/mp sebességgel is képesek elemezni a sejteket. A nagy sebességű analízis – a multikolor festéssel együtt alkalmazva – elősegítheti az igen ritka előfordulású sejtek kimutatását (ritka események). A ritka események kimutatásában követett áramlási citometriás protokollokat rutin módon alkalmazzák a reziduális leukaemiás sejtek azonosításában a terápia megkezdését követően, illetve a diagnosztika és terápia más területein is.

A genetikai betegségek szűrése

Egyes genetikai megbetegedésekben megváltozik egyes karakterisztikus sejtfelszíni fehérjék expressziója. Amennyiben az érintett sejtek jelen vannak a perifériás vérben, egyszerű szűrőteszt fejleszthető ki a genetikai rendellenességek kimutatására. E módszer alkalmas lehet a thormbocyta-zavarok (Glanzmann-thrombasthenia, Bernard−Soulier-szindróma), a leukocyta-adhéziós deficiencia és az X kromoszómához kötött hyper-IgM szindróma kórismézésében.

A jövő irányai

A fejlesztés egyik legizgalmasabb iránya a képalkotó citometria, mely a maga valójában ábrázolja a vizsgált sejtet.

(Forrás: Virgo PF, Gibbs GJ. Flow cytometry in clinical pathology. Ann Clin Biochem 2012; 49: 17–28.)