Az áramlási citometria alkalmazása a szervtranszplantációban

A jelen összefoglaló az áramlási citometria lehetséges alkalmazásait tekinti át a szolid szervek transzplantációja kapcsán. A citometriának a HLA (humán leukocyta antigén) poszttranszplantációs monitorozása, az opportunista vírusfertőzések kontrollja, valamint az immunrendszer sejtes komponenseinek monitorozása terén lehet szerepe.

HLA-antitest monitorozása a transzplantáció után

Korábban a komplementdependens szerológiai módszerek szolgáltak gold standardként ezen a téren. Azt tartották, hogy a citotoxikus antitestek jelenléte előre jelzi a graft destrukcióját, míg hiányuk kedvező kimenetelt vetít előre.

Az értékelés két feltételezésen alapult: 1) a vizsgálatok a rejekciót kiváltó összes antigént képesek kimutatni; és 2) az összes kimutatott antigén káros a graft túlélésére nézve. Valójában a két feltevés egyike esetében sem ritkák a kivételek. Előfordulhat, hogy a citotoxikus módszerekkel azonosított lymphocyta-antigének nem is merik fel a HLA-t és nem indítanak el olyan folyamatot sem, mely végül a beültetett szerv kilökődéséhez vezet – ez különösen az autoimmun természetű antitestekre igaz. Továbbá, jóllehet az IgM osztályba tartozó antitestek képesek a komplement aktivációra, klinikailag mégsem jelentősek. Mindezek következtében a korábban alkalmazott módszerek specificitása alacsony volt, azaz nagy volt az álpozitív reakciók aránya.

Ugyanakkor a citotoxicitáson alapuló tesztek esetében nagy volt az álnegatív leletek aránya is. Az alacsony titerben jelen lévő antitestek in vitro körülmények között nem mindig vezettek a komplementrendszer aktiválódásához, miközben in vivo komplementdependens rejekciót válthattak ki.

Az áramlási citometriának transzplantált betegeknél történő alkalmazása megoldotta a komplementdependens eljárások számos hátrányát. A direkt immunfluoreszcencia által biztosított fokozott szenzitivitás hathatósan ellensúlyozza az alacsony antigéntiterből adódó problémákat. Az altípus-specifikus monoklonális antitestek a sejtpopulációk elektronikus disszekciója révén módot nyújtanak az I. és II. osztályba tartozó HLA elleni antitestek azonosítására. Az áramlási citometriának az a képessége, hogy a komplementfixációtól függetlenül képes azonosítani az antitestet, lehetővé teszi a klinikailag releváns immunglobulinok széles tartományának kimutatását. Az áramlási citometria kifejlesztése emelte az eljárás specificitását is, és az aspecifikus IgM-osztályba tartozó auto- és alloantitesteknek tulajdonítható álpozitív reakciók teljesen kiküszöbölhetővé váltak.

A poszttranszplantációs opportunista fertőzések kontrollja

Az áramlási citometria előnye a citokin tesztekkel szemben, hogy nemcsak az intracelluláris citokintermelésre vonatkozóan nyújt információkat, hanem értékes fenotipizálási adatokkal is kiegészíti az analízist, részletes információkat nyújtva a T-sejtek alosztályairól.

A kutatások alapján a CD8+ és/vagy CD4+ CAST-ok (CMV-antigén-specifikus T-sejtek) védelmet nyújtanak a CMV-fertőzéssel szemben, illetve a CD4+ CAST-ok számának meghatározása pontosabban jelzi előre a CMV-betegséget. Ugyanakkor a keringő CAST-ok száma és a funkcionális anti-CMV immunitás közötti korreláció gyenge. Az antigénspecifikus sejtek mindössze fele képes proliferációra vagy citokintermelésre.

Az áramlási citometria hatékonyan alkalmazható a CD4+ és CD8+ CAST-ok funkcionalitásának megítélésére, illetve az idősebb és fiatalabb betegek között a graftválaszban mutatkozó különbségek felmérésére. Ezek a vizsgálatok is arra utalnak, hogy nem minden CAST „funkcionális”, és az erre vonatkozó információ a CMV-reaktiváció és -betegség valószínűségének járulékos prediktora lehet.

A polifunkcionális antigénspecifikus T-sejtek védő hatással bírhatnak az immunválaszban, ezért hasznos paraméterként szolgálhatnak a poszttranszplantációs vizsgálatok során. Az áramlási citometria ugyancsak jól használható a CAST-funkcióra kifejtett terápiaspecifikus hatások felismerésében. Kimutatták, hogy calcineurin-inhibitorok, cyclosporin A vagy tacrolimus hatására a CAST-ok elveszítik TNFalfa- és IL-2-termelő képességüket, az IFNgamma esetében azonban már nem mondható el ugyanez.

A regulátor sejtek és más immunsejt-alosztályok monitorozása

Az áramlási citometria alkalmazható a sejtszám meghatározására, a sejtpopulációk arányának megadására, illetve a különféle sejtaltípusok aktivációs státuszának megítélésére. Ezek közül is a leggyakoribb az abszolút CD3+ T-sejt-szám, a CD4+:CD8+arány, valamint a CD69- vagy HLA-DR-expresszió meghatározása a CD3+, illetve CD8+ T-sejteken. Azon betegek esetében, akiknél a kezelés részét képezi anti-IL-2-receptor antitestek (pl. basiliximab) alkalmazása, az áramlási citometria a CD25-blokád igazolására használható. Különös érdeklődésre tarthat számot a CD4+ Treg, mivel ennek emelkedett gyakorisága a transzplantált betegeknél megbízható korrelációt mutat a graftrejekció csökkent kockázatával. Ezek a populációk elsődlegesen áramlási citometria segítségével azonosíthatók azáltal, hogy képesek felismerni a CD4- és CD25-expressziót, valamint a transzkripciós mesterregulátornak tekinthető FoxP3-at.

A vizsgálatok azt jelezték, hogy ezek a Treg-populációk az indukált Treg-ek perifériás expanziójára vezethetők vissza a donorantigénekre adott válaszként, illetve természetes Treg de novo képződése révén is kialakulhat.

A transzplantátum toleranciájának növelése szempontjából jelenleg azoknak a klinikai beavatkozásoknak lehet jelentősége, melyek megvédik a recipiens Treget az immundeplációtól. Állatmodellekben a Treg indukciója történhet rapamycinre vagy anti-thymocyta globulinra (ATG) adott válaszként is, ami igen ígéretes lehet a klinikai alkalmazás szempontjából.

Az áramlási citometria segítségével egyéb regulátor T-sejt-altípusok is kimutathatók, ám ezek szerepe kevéssé tisztázott a tolerancia kialakulásában. A transzplantátum toleranciájának kialakításában a CD8+/CD28Neg alcsoport kiemelt klinikai jelentőséggel bírhat, mivel ezek révén betekintést nyerhetünk az immunológiai öregedés folyamatába – ez egy olyan állapot, mely javíthatja a graft túlélési esélyeit, illetve csökkentheti a hosszú távú immunszuppresszív terápia kapcsán fenyegető szövődmények előfordulásának esélyét. Az immunológiai öregedés jellegzetessége a csökkent immunaktivitás, mely elsősorban idős korban figyelhető meg, de fiatalabb korban is beszámoltak már róla CMV-fertőzésre adott válaszként.

Az említett regulátor CD8+/CD28Neg sejtek szorosabb korrelációt mutatnak a klinikai kimenetellel. Nemrégiben belataceptet alkalmaztak a CD28 blokádjára. E szer egy CTLA4-Ig(Fc) fúziós protein, mely nagy affinitással kötődik a CD80-hoz és CD86-hoz, ezáltal gátolva a CD28-hoz való kötődést, melynek következtében T-sejt-anergiát indukál azáltal, hogy megzavarja a szükséges kostimulátoros szignált.

A belatacept immunsejtekhez való kötődését áramlási citometriával lehet nyomon követni. Érdekes megfigyelés, hogy a regulátor T-sejtek magas szintje transzplantáción átesett betegeknél kétélű kardként szolgálhat, mivel az emelkedett Treg-szám korrelációt mutat a rosszindulatú tumorok megjelenésével. Valójában azt javasolják, hogy a CD28-expresszió áramlási citometriával történő mérése potenciális biomarker lehet a transzplantáción átesett betegeknél előforduló malignitások előrejelzésében.

Összefoglalás

Az immunműködés monitorozása alapvető jelentőségű a szolid szervek transzplantációjának nyomonkövetésében, hogy biztosíthassuk a graft és a recipiens megfelelő állapotát. Az áramlási citometria egyedülálló lehetőséget kínál a recipiens immunstátuszának felmérésében. Meg kell jegyezni, hogy a fenti áttekintésben tárgyal vizsgálómódszerek jelentős hányada csak kellő körültekintéssel alkalmazható, mivel a standardizálás egyelőre várat magára, mielőtt a teszt klinikai elfogadást nyerne. Erőfeszítéseket kell tennünk e tesztek validálására.

(Forrás: Maguire O, et al. Flow cytometry and solid organ transplantation: A perfect match. Immunol Invest. 2014;43:756−774.)