Mikrobiológiai diagnosztika – hol tartunk 2015-ben?
Az infekciós kórképek mikrobiológiai diagnosztikája forradalmi változásokon megy át. A cél a kórokozó kimutatása és az antimikrobás szerrel szembeni rezisztencia mielőbbi meghatározása, az empirikus terápia célzottá tétele. A ma már rutinszerűen alkalmazható nukleinsav- vagy proteinalapú, sok esetben automatizált molekuláris módszerek nemcsak érzékenyebb kórokozó-kimutatást tesznek lehetővé, hanem számos esetben jelentősen csökkentik a leletátfutási időt. Kérdés, hogy a hazai laboratóriumok milyen mértékben képesek ezeket a költséges vizsgálatokat a betegellátás szolgálatába állítani. Mind a klinikusnak, mind a mikrobiológusnak tisztában kell lennie az ezekkel a módszerekkel kapott eredmények klinikai használhatóságával.
A fertőzéses eredetű kórképek mikrobiológiai diagnosztikája az elmúlt évtizedekben rohamos fejlődésen ment keresztül, azonban a nukleinsav- és proteinalapú módszerek térhódítása sem teszi elhanyagolhatóvá a hagyományos mikrobiológiai módszerek mindennapi alkalmazását. Ez azt jelenti, hogy egy csupán molekuláris módszereket használó mikrobiológiai diagnosztikai laboratórium nem alkalmas az infektológia széles területének kiszolgálására. A mikroorganizmusok felfedezése óta nyilvánvaló, hogy a fertőző megbetegedések hatékony gyógyítását jelentősen elősegítik a kórokozók kimutatására, valamint antimikrobás szerekkel szembeni érzékenységük meghatározására szolgáló mikrobiológiai módszerek. Különösen igaz ez napjainkban, amikor az orvostudomány fejlődése következtében egyre nagyobb számban kerülnek sérült immunitású betegek kórházi vagy kórházon kívüli kezelésre, több esetben olyan kórokozókkal történt fertőzés következtében, amelyek nem sorolhatók a hagyományos humán patogén mikrobák közé. A sérülékeny, kis súlyú koraszülöttek és a kitolódott életkor következtében a populáció nagy részét kitevő idősek infekciói szintén komoly kihívást jelentenek az infektológusok számára. A testidegen, beültetett eszközök használatánál szükségszerűen megjelenő biofilmképzés okozta terápiás sikertelenség, valamint az egyéb okok miatt folyamatosan növekvő antibiotikum-rezisztencia egyre kétségesebbé teszi az empíria alapján történő kezelést a súlyos infekciós kórképek esetében. A baktériumok és gombák okozta infekciók során a hagyományos módszerekkel történő izolálást követő rendszertani besorolásuk mellett egyre nagyobb jelentőségű az antibiotikumokkal, antifungális szerekkel szembeni érzékenységük meghatározása, amely sok esetben a klinikum által tolerálható időintervallumot jelentősen meghaladja. A paraziták okozta kórképekben a hagyományos módszerek között elsődleges szerepük van a mikroszkópos vizsgálatoknak és a szervezet által adott válaszreakció kimutatásának szerológiai módszerekkel. A víruseredetű kórképek hagyományos diagnosztikája a tenyészthető vírusok szövetkultúrában való izolálásán alapszik, az általuk okozott, sokszor jellegzetes citopátiás hatás alapján, illetve a szervezet válaszreakciójának szerológiai módszerekkel történő vizsgálatán. Mindezek a hagyományos módszerek amellett, hogy széles körű tapasztalattal rendelkező mikrobiológust igényelnek, meglehetősen hosszadalmas eljárások.
Az elmúlt időszak mikrobiológiai diagnosztikát érintő változásai elsősorban bizonyos laboratóriumi folyamatok automatizációját érintették. Ezzel például drámaian csökkent a hemokultúra-vizsgálatok időtartama: 4-5 nap helyett – megfelelő időben történt mintavétel esetén – akár néhány óra alatt előzetes diagnózis adható a szeptikus betegség kórokozójáról. Baktériumok és a sarjadzó gombák meghatározott körének species szintű identifikálása ma már idő- és költségkímélő módon miniatürizált, automatizált identifikáló rendszerekkel történik a legtöbb hazai mikrobiológiai laboratóriumban is. Ezzel párhuzamosan az identifikáló rendszerek automatikus antibiotikumrezisztencia-meghatározást is lehetővé tettek. Az egyre tisztább és specifikusabb bakteriális, virális, gomba- és parazitaeredetű antigének előállításával hatékonyabbá vált a szervezet immunválasza alapján történő diagnosztika is. A szerológiai diagnosztikában leggyakrabban használt enzimimmunoesszék (ELISA módszer) kifejlesztése és automatizációja lehetővé tette az ilyen jellegű vizsgálatok végzését nagy tömegben és rövid idő alatt. Ugyanezen elv alapján – specifikus ellenanyagok felhasználásával – lehetővé vált baktériumok, gombák, vírusok, paraziták jelenlétének gyors kimutatása közvetlenül a betegek különböző vizsgálati anyagaiból vagy a pozitív jelzést adó hemokultúra-palackból. Ma is költséghatékony diagnosztikus módszer a Streptococcus pneumoniae vagy Legionella pneumophila okozta infekció esetén az antigén kimutatása a vizeletből.
Az igazi nagy változás a mikrobiológiai diagnosztikában akkor következett be, amikor a nukleinsav-alapú módszerek kikerültek a kutatólaboratóriumokból, és egyre több mikroorganizmus nukleinsavának részbeni vagy teljes szekvenciaanalízise lehetővé tette hatékony diagnosztikus eljárások fejlesztését mind a klinikai, mind a járványügyi mikrobiológia számára. Nemcsak a diagnosztikai idő lett rövidebb, hanem egy érzékenyebb és sok esetben specifikusabb kimutatási módszert eredményeztek ezek a fejlesztések. A polimeráz-láncreakció (PCR) kidolgozásával lehetőség nyílt kis mennyiségű kórokozó direkt kimutatására vizsgálati anyagból azon mikroorganizmusok esetében is, amelyek más módszerekkel (pl. tenyésztés) nehezen vagy egyáltalán nem mutathatók ki. Ez az eljárás egyértelműen forradalmasította olyan víruseredetű kórképek diagnosztikáját, amelyek direkt kimutatására más módszer nem állt rendelkezésre (HPV, HCV, HIV stb.). Baktériumok esetében elsősorban olyan kórokozók diagnosztikájában hozott előrelépést a PCR-vizsgálat, amelyek különleges tenyésztési eljárást igényelnek (pl. Chlamydia trachomatis), a mintavételt követően gyorsan elpusztulnak, így nehezen tenyészthetők (pl. Neisseria gonorrhoeae), illetve ahol csak nagyon hosszú inkubációs idő után válnak pozitívvá a tenyészetek (pl. Mycobacterium tuberculosis). A kezdeti, úgynevezett „home made” eljárások mellett hamarosan kész kitek jelentek meg a diagnosztikai palettán a legkülönbözőbb mikroorganizmusok kimutatására a betegtől vett anyagból. A mintából történő nukleinsav-izolálás automatizálása, valamint a megfelelően programozható PCR-automaták megjelenése a nukleinsav-alapú módszerek széles körű elterjedését tette lehetővé a mikrobiológiai diagnosztikában. Szemben az érzékenyebb és gyorsabb diagnosztikával azonban a nukleinsav-alapú gyári kitek alkalmazása jelentős költségnövekedést hozott a laboratóriumok számára.
A PCR-módszer fejlesztése számos további irányba indult meg. A multiplex PCR-kitek esetében, amikor a vizsgálati mintából egy időben több, sokszor rendszertanilag távol eső mikroorganizmus kimutatását kíséreljük meg, bár technikai nehézségek merülhetnek fel a kivitelezés során, jókora előrelépést jelenthet mind időben, mind a munkaerővel történő spórolás szempontjából. A patogénspecifikus nukleinsav mennyiségi mérése hamar elvárássá vált a klinikum oldaláról, különösen egyes vírusfertőzések terápiájának követése során (HCV, HIV), de fontos lehet annak eldöntésében, hogy a kimutatott mikroorganizmus valódi patogén vagy csupán kolonizáló flóra. A valós idejű („real-time”) PCR-rendszerek jelenleg a legfejlettebb eljárások a PCR-diagnosztikában, és a mennyiségi meghatározás mellett megvan a lehetőség a többszörös patogén egyidejű kimutatására és a kapott termék hibridizációval való konfirmálására is. Tovább gyorsíthatja a „real-time” PCR-módszer a szepszis vagy a pneumonia diagnosztikáját azáltal, hogy több lehetséges patogén kvantitatív kimutatására képes, ezzel lehetőséget adva a klinikusnak a megfontoltabb terápia indítására. Mindezek az új lehetőségek természetesen nem teszik feleslegessé a hagyományos eljárásokat, hiszen például a szepszis PCR-módszerrel direkt a vérből kimutatott kórokozójának antibiotikum-érzékenysége csak a tenyészetből határozható meg, ami feltétele az empirikus terápia célzottá tételének. A kimutatásra használt multiplex PCR-kitek másrészt csak a leggyakoribb szepszispatogének detektálására alkalmas primereket (specifikus nukleinsavdarabokat) tartalmazzák.
Bizonyos esetekben egy-egy rezisztenciagén detektálása segíti a multirezisztens, sokszor nozokomiális baktérium detektálását közvetlenül vizsgálati anyagból vagy tenyészetből. A meticillinrezisztens Staphylococcus aureus- (MRSA-) hordozás detektálása, illetve klinikai mintából izolált Staphylococcus esetében annak igazolása, hogy MRSA-törzsről van-e szó, az erre a célra fejlesztett „real time” PCR-berendezésekkel akár egy órán belül lehetséges. Ez az információ nemcsak a terápia meghatározása szempontjából fontos, hanem járványügyi, kórházhigiénés intézkedések kiindulópontja lehet. A betegellátás szempontjából, de kórházhigiénés intézkedés szempontjából is fontos pl. a toxintermelő Clostridium difficile jelenlétének kimutatása a hasmenéses beteg székletmintájából PCR-módszerrel, jelentősen lerövidítve e fontos nozokomiális enterális patogén által okozott kórkép diagnosztikáját. Mindkét utóbbi eljárás már olyan mértékben egyszerűsített, automatizált, hogy bármely rutin klinikai mikrobiológiai laboratórium végezheti.
A járványügyi mikrobiológia területén számos molekuláris módszer segíti a nozokomiális járványok felderítését, követését helyi, országos szinten vagy világszerte. Így például a „pulsfield gel electrophoresis” (PFGE), a „restriction fragment length polymorphism” (RFLP), a „random amplification of polymorphic DNA” (RAPD) vagy a „multilocus sequence typing” (MLST) ad lehetőséget azonos speciesbe tartozó törzsek rokonsági fokának, azonosságának igazolására. A molekuláris tipizáló módszer alkalmazása elsősorban nagyobb centrumokban, járványügyi referencialaboratóriumokban célszerű.
A mikrobiológiai laboratóriumokban ma már számos országban rutinszerűen alkalmazott proteinalapú tömegspektrometriás eljárás, a „matrix assisted laser desorption/ionisation time of flight mass spectrometry” (MALDI-TOF MS) a riboszomális fehérjék analízise alapján nyújt lehetőséget a kitenyésztett baktériumok és gombák igen széles körének species szintű azonosítására néhány perc alatt. Egyre bővülő adatbázissal végezhető a szokványos kórokozókon túl az anaerob baktériumok, mycobacteriumok, csak immunszupprimáltak esetében patogén környezeti baktériumok, sarjadzó és fonalas gombák szekvenálással megegyező hatékonyságú identifikálása. Az elmúlt évek fejlesztése lehetőséget biztosít steril testtájakról származó vizsgálati anyagban kórokozók azonosítására, vagy pozitív hemokultúra-palackokból baktérium/gomba meghatározására. Számos közlemény igazolja a módszer alkalmasságát egyes baktériumok tipizálására, és a rezisztenciameghatározás tömegspektrometriás módszerének kidolgozása a közvetlen közeljövőben várható.
Kérdés az, hogy a rendelkezésre álló vagy fejlesztés alatt lévő módszerek közül melyek azok, amelyek költséghatékonyan, megfelelő szaktudással megválasztva válnak használatossá a hazai laboratóriumokban. Ezek a nagy hatékonyságú, gyors, de sokszor költséges módszerek csak igen meggondolt, infektológiai tudással rendelkező klinikusi vizsgálatkérés esetén adnak klinikailag hasznosítható eredményeket. Már a jelen, de még inkább a jövő orvosi-klinikai mikrobiológusának elengedhetetlen feladata a klinikus kollégák informálása az új módszerek nyújtotta lehetőségekről, valamint előnyeikről és korlátaikról. Még inkább felértékelődik az orvosi-klinikai mikrobiológus szerepe az e módszerekkel kapott eredményeknek a betegadatok ismeretében történő megfelelő interpretálása területén.
