Áramlási citometriás technikák: amit érdemes egy háziorvosnak tudni róluk

Az áramlási citométer folyadékban levő – szolubilis – sejtek és részecskék detektálására alkalmas. Ezért különösebb hókuszpókusz nélkül lehet vele perifériás vérből, illetve csontvelői biopsziában levő sejteket vizsgálni. Egyéb szövetekből, letapadó sejttenyészetekből csak a sejtek oldatba vitelét követően lehet mérést végezni.

A citométerek tulajdonképpen egyszerű jószágok. A gyártónak csupán a mintavevő és -továbbító részt, egy  vagy több lézert, a detektorokat és az adatfeldolgozó egységet kell  megfelelően összeillesztenie. És már kész is van az ESZKÖZ, amivel másodpercenként akár több tízezer sejtről is lehet adatot kapni. A lényeg – mint annyi minden egyébnél – itt is a részletekben van.

Az áramlási citométer egy csőrendszerbe szívja fel a mintában levő sejteket, részecskéket. Itt egy olyan speciális részbe kerülnek, ahol egy sejt szélességű folyadékoszlopba rendeződnek (szaknyelven ezt ’hidrodinámiás fokuszálásnak’ nevezik). Ezt az oszlopot világítja meg egy vagy több lézernyaláb.

A lézer az oszlopon – amennyiben éppen nincs jelen sejt benne – akadálytalanul jut át. Ha viszont sejt vagy egyéb részecske kerül az útjába, a lézer fény szóródik. Előre és oldalra, amit a megfelelően elhelyezett detektorokkal észlelnek. A szóródás mértékét alapvetően két dolog befolyásolja. Az előre való szóródást a sejt mérete (ez az FCS-nek nevezett paraméter – forward scatter névre hallgat); az oldalra való szóródást a sejt szerkezete, granuláltság (ez pedig az SSC, vagy side scatter).

A sejteket a róluk kapott FSC és SSC jelek alapján az eszköz egy FSC-SSC koordináta rendszerben besorolja. Így jönnek létre az ún. felhődiagramok. A felhődiagramokon jól elkülönülnek a perifériás vérben jelen lévő fehérvérsejt-csoportok – a kisméretű és nem granulált (kis FSC, kis SSC) limfociták, a nagy és granulált (nagy FSC, nagy SSC) neutrofil granulociták vagy a nagy, de nem granulált (nagy FSC, kis SSC) monociták. A vérképeket mérő hematológiai automaták is többnyire ezen az elven különítik el a fehérvérsejt-alcsoportokat.

Az áramlási citométer egy átlagosa hematológiai automatához képest abból a szempontból tud többet, hogy nemcsak az FSC / SSC paramétert, de meghatározott hullámhosszokon fluoreszcens fényt is tud detektálni.

Rendelkezésre állnak olyan speciális ún. fluoreszcens vegyületek, melyek egy adott hullámhosszú fénnyel történő gerjesztés hatására meghatározott hullámhosszú fényt bocsátanak ki. Ezek ellenanyagokhoz köthetők. Olyan ellenanyagokhoz, melyeket pl. sejtfelszíni antigénekkel szemben termeltettek. Ezek a sejtfelszíni antigének jellegzetesek egy adott sejtcsoportra; röviden a ’cluster of differentiation’ kifejezés rövidítése alapján CD markerként emlegetik őket.

A sejtfelszíni CD-markerekhez kötődő, fluoreszcens festékkel  jelzett ellenanyagok lézer hatására fényt bocsátanak ki. Azaz: kivilágítják azokat a sejteket, melyek, az adott CD-markert hordozzák. Minél erősebben világít egy sejt az adott színű festék hatására, annál kifejezettebben van jelen az adott CD-marker rajta.  Egy sejt sokféle CD-markert jeleníthet meg. Egy CD-marker kombináció alapján speciális sejtcsoportok (pl. ’aktivált Th2-polarizált CD4+ T sejtek’ csoportja) azonosítható.

Az áramlási citométeres vizsgálat kapcsán különböző színű festékekkel különböző ellenanyagokat jelölnek, melyek többé-kevésbé kötődnek a sejtfelszíni antigénekhez. A létrejövő színkombinációból az egyes színeket az áramlási citométer detektorai észlelik. A készülék a sejteket aszerint sorolja be, hogy a színmintázat egyes elemei milyen erősen jelennek meg.

Az áramlási citométer tehát komplex képet tud adni egy sejt  sejtfelszíni antigénmintázatáról. Egyes rendszerek egyidejűleg több mint egy tucat paraméter detektálására alkalmasak. Minden egyes ‑ másodpercenként akár 40 ezer ‑ vizsgált sejt esetében. Ez óriási távlatokat ad a hematológia számára: lehetővé vált egyszerre akár több tucat – köztük igen ritkán előforduló  sejttípusok – egyidejű kimutatása, számának meghatározása is.

A CD-markerek mellett más antigénekkel is rendelkeznek a sejtek. Például intracelluláris enzimekkel, struktúrfehérjékkel. A sejtekbe juttatott fluoreszcens festékekkel jelzett ellenanyagokkal ezek jelenléte is vizsgálható. Sőt, mivel a foszforiláció hatására egyes fehérjék térszerkezete megváltozik, így a foszforilált – nem foszforilált fehérjék aránya is mérhető. Igen izgalmas alkalmazási lehetőséget jelentenek azok a festékek, melyek az ionerősség, a pH vagy a szabad kalciumszint megváltozása esetén bocsátanak ki fényt. Segítségükkel a sejtben zajló folyamatok monitorozhatók, pl. nyomon lehet követni, hogy egy inger hatására hogyan változik egy adott sejtpopulációban időben a kalciumszint.

A háziorvosi diagnosztikában – egyelőre – nincs szerepe az áramlási citométereknek. Klinikai célra ezeket a készülékeket és eljárásokat ma Magyarországon döntően a hemato-onkológiai vizsgálatok során immunfenotipizálásra használják. Csontvelői és/vagy perifériás vérminta vizsgálata alapján besorolható, hogy a beteg milyen típusú hematológiai malignitásban szenved, monitorozható a kezelésre adott válasz, vagy a reziduális sejtek is kimutathatók.  A patológusok és a laborosok munkáját egyaránt kiegészíti, így Magyarországon sem egységes, melyik szakmához tartozók felségterülete. (Az egyetemek közül Debrecenben és Pécsen a laborosok, Szegeden és Budapesten a patológusok fennhatósága alá tartozik.)

Ezen kívül a rutin alkalmazási területe része egyes vörösvérsejt-membrándefektusok kimutatása, thrombocyta-funkciók értékelése. HIV-fertőzötteknél a CD4 sejtszám áramlási citométerrel monitorozható, egyes kezelési protokollokat ez alapján állítanak be (ezért léteznek külön CD4-sejtszám mérésére alkalmas célkészülékek is). A csontvelő transzplantáció során az őssejtek kimutatása jellegzetes markerek alapján szintén ilyen technikával történik. Egyes ritka immunológiai kórképekben, pl. fagocitózis zavarai esetén is diagnosztikus értéke van az erre a célra kidolgozott áramlási citometriás teszteknek.

Új ígéretes áramlási citometriás felhasználási terület szolubilis paraméterek meghatározása biológiai mintában. Különböző színárnyalatú gyöngyök felszínére kötnek olyan ellenanyagokat, melyek kihorgásszák a vizsgálandó vegyületeket. Például citokineket, hormonokat, kisebb-nagyobb méretű biológiailag aktív anyagokat. Második lépésben a kihorgászott vegyületekhez kötődő másodlagos jelzett ellenanyagokat adnak a rendszerhez; így a gyöngyök – attól függően, hogy mennyi anyagot kötöttek meg – különböző erősségű színnel fognak lézer fény hatására világítani. A vizsgálat során a gyöngyök alapszíne, illetve a világítás erőssége alapján egyidejűleg több (optimálisan akár 100) különböző anyag szintjét lehet egyidejűleg mérni a mintából. Ennek olyan kutatások során van jelentősége, amikor a szervezetben egy komplex rendszer, pl. gyulladásos válasz során bekövetkező választ kell jellemezni.

A sejteken végzett áramlási citometriás vizsgálatok céljára alvadásgátolt – optimálisan additívként heparint tartalmazó – vérmintát használnak. Fontos: a levett vérmintát mielőbb a laborba kell juttatni. A küldés előtt a vért TILOS hűtőbe tenni, mindenképpen szobahőmérsékleten kell tárolni. Az áramlási citometriás vizsgálat teljes vérből, vagy a mintából izolált sejteken  történhet, a sejtek jelölt antitestekkel történő jelzése után.

Hematoonkológiai vizsgálatok esetében a kiadott lelet többnyire interpretatív, azaz az áramlási citometriás eredményt a vizsgálatot végző orvos részletesen elemzi és a klinikai kép alapján értelmezi.

Továbbképző cikk!               

A cikkhez kapcsolódó akkreditált kvízért kattintson ide!