A mikrobiom vizsgálatának sajátosságai

Az ember bőrfelületén, bélrendszerében és minden, a külvilággal kapcsolatba kerülő testüregében hatalmas tömegben élnek mikroorganizmusok, számukat összesen 10¹⁴ nagyságrendűnek becsülik, ami tízszerese az emberi szervezet sejtszámának.

Ma már számos információval rendelkezünk a mikrobiomról – a mikrobiótát alkotó mikroorganizmusok genomjairól – és annak a szerepéről, és ismert, hogy a mikrobiom szerepe a betegségek kialakulásában sokkal fontosabb tényező, mint korábban feltételeztük. Az új technológiák, mint a DNS-szekvenálás vagy a bioinformatika alkalmazása nagymértékben hozzájárultak ennek a tudományterületnek a fejlődéséhez. Az ökológia, molekuláris taxonómia, evolúciós orvostudomány ismeretei más megvilágításba helyezték a normálflóra szerepét. A hangsúly a patogének és virulenciamechanizmusaik vizsgálatáról átterelődött a kolonizáció, valamint a mutualizmus és a gazdaszervezet kölcsönhatására. Ez az új megközelítés vezetett a mikrobiomvizsgálat forradalmához és szemléletváltáshoz (1, 2).

A mikrobiom elemzése       

A humán mikrobiom elemzése során a mikrobiális közösségek összetételét és azoknak az emberi szervezetre kifejtett hatását vizsgálják. A cél az emberi mikrobiom szerepének megértése, a különböző mikrobák tevékenységének feltárása az egészség és a különböző elváltozások, betegségek hátterében.

A mikrobiomminták vizsgálata során a legkülönbözőbb klinikai minták analízisére kerül sor, mint például bélflóra, szájflóra, bőrflóra, hüvelyflóra stb. A legtöbbet vizsgált minta a bélflóra, ahol fontos megjegyezni, hogy többféle székletmintát lehet vizsgálni. Ezek megjelölése különösen fontos, hogy az eredmények összehasonlíthatóak legyenek, hiszen más a normálflóra a bél különböző szakaszain, tekintettel a vékony- és vastagbél különböző fiziológiás körülményeire. Például a bélrendszerben lefelé haladva a pH emelkedik, az oxigénszaturáció csökken, az antimikrobiális anyagok mennyisége csökken és a baktériumok mennyisége nő. Fiziológiásan is eltér a béllumen, illetve bélmucosa flórája is. Ezért a székletminta mikrobiom-meghatározása, ami a mikrobiom-vizsgálatokban a leggyakrabban alkalmazott stratégia, hiányos és torzított adatokat eredményez, mivel a minta homogenizálása miatt elvesznek a különböző nyálkahártya-közösségek és térbeli heterogenitás miatti különbségek, amelyeknek jelentősége lehet (3, 4, 5).

A mikrobiomminták vizsgálata hagyományos mikrobiológiai módszerekkel nem lehetséges. A hagyományos tenyésztési módszerekkel az izolált mikroorganizmusok jellemezhetők, fenotípusos vagy genotípusos vizsgálatokkal. Ráadásul a mikrobiom közösségét alkotó számos mikroorganizmus hagyományos módszerekkel nem tenyészthető, így jelenlétüket a hagyományos eljárásokkal nem is lehet detektálni. Következésképpen a mikrobiális közösség jellemzése a klasszikus módszerekkel nem lehetséges.

Új vizsgálati eljárások        

A molekuláris technikák fejlődésével új lehetőségek nyíltak meg a mikrobiális közösség jellemzésére. A szekvenálásalapú metagenomika alkalmas komplex mikrobiális közösségek pontos összetételének meghatározására anélkül, hogy a közösség egyes tagjait izolálni, tenyészteni kellene. Továbbá információt nyújt a metagenomika a mikrobák együttműködéséről, a közösségi szintű anyagcsere-folyamatokról is. A vizsgálatok alapja a közösségekből kivont DNS gyors és nagy áteresztőképességű meghatározása next-generation szekvenálással (NGS), amellyel a teljes közösség – beleértve a nem tenyészthető mikrobákat is – genomját is vizsgálni lehet. Ellentétben a kapilláris szekvenálással és a PCR-alapú megközelítésekkel, az NGS lehetővé teszi több ezer mikroorganizmus párhuzamos szekvenálását. Így összekapcsolva több mintát egyetlen szekvenálás alatt, magas a szekvencialefedettség mintánként és képesek érzékelni a mikrobiális közösségben csak nagyon kis mennyiségben jelen lévő mikroorganizmusokat is, amelyeket más módszerekkel nem lehet azonosítani (6, 7).

Az emberi mikrobiom vizsgálata során a kísérletes NGS következő vizsgálati módszereit alkalmazzák: shotgun metagenomika-szekvenálás, 16S riboszóma-RNS-szekvenálás és metatranszkriptomika.

A next-generation szekvenálás módszerei               

A shotgun metagenomikai szekvenálás lehetővé teszi komplex mintákban is minden jelen lévő mikroorganizmus minden génjének az átfogó vizsgálatát. Lehetőséget ad a nem vagy nehezen tenyészthető mikroorganizmusok detektálására és analízisére is. Az eljárás lehetővé teszi a bakteriális sokszínűség és sokféleség kimutatását.

A metagenomikai vizsgálatokat gyakran a prokarióta 16S rRNS gén szekvenálásának elemzésével végzik el. A 16S RNS egy körülbelül 1500 bp hosszúságú génszakasz, kilenc variábilis régiót tartalmaz, konzervált részekkel megszakítva. 16S riboszóma-RNS gén variábilis régióinak meghatározott szakaszainak amplifikálását, majd szekvenálását használják egy adott mintában a jelen lévő baktériumok filogenetikai besorolásához. Azt, hogy melyik 16S rRNS-régió kerül amplifikálásra, illetve szekvenálásra, a minta típusa, illetve a kísérlet körülményei határozzák meg (8, 9).

A metatranszkriptomikasorán a mikrobiális genomról átíródó RNS-molekulák vizsgálata történik next-generation RNS-technikával, amely fontos információt nyújt az aktív folyamatokról, a gazda-mikroba kölcsönhatásról is.

A mikrobiom-kutatás eredményei

A mikrobiom összetétele és diverzitása változik az életkorral, a diétával, antibiotikumok hatására és számos folyamatban például az immunrendszer, központi idegrendszer érésében is fontos szerepet játszik. Egyre több megbetegedéssel – intestinalis kórképekkel, metabolikus zavarokkal, autoimmun folyamatokkal, központi idegrendszeri elváltozásokkal, krónikus gyulladással, daganatképződéssel – hogy csak néhányat említsünk – hozzák összefüggésbe a mikrobiom változását (10).

Az új kutatási eredmények elvezethetnek a „gyógyító mikrobák” egyenkénti (külön-külön) vagy populációszintű alkalmazásához. A bél különböző dysbacteriosisainak kezelésében fontos szerepet kapnak a hasznos baktériumok tápanyagául szolgáló prebiotikumok, illetve magukat a jótékony baktériumokat (Lactobacillus, Bifidobacterium) probiotikum formájában is használják kezelésre.

A mikrobióta populációszintű alkalmazása már most megvalósul a széklettranszplantáció során, a Clostridum difficile-fertőzések kezelésére (11).

Összegzés     

 A mikrobiom-kutatás, mint új tudományterület az utóbbi 10 évben rohamos fejlődésnek indult, a technológiai előrelépéseknek köszönhetően. Az eddigi kutatások eredményeiből most kezd körvonalazódni a mikrobiom variabilitása, stabilitása, fejlődése, összetételének megváltozása, valamint a gazdaszervezetre gyakorolt pozitív és negatív hatása. Napjainkban a mikrobiom-kutatás fő irányai a bakteriális, metagenomikai vizsgálatok mellett az újonnan vizsgált virom-, mykom-, transzkriptom-, proteom- és metabolomkutatások. Ezek eredményeképpen egyre több adat áll majd rendelkezésre, hogy a mikrobiom összetételét és a gazdaszervezetre kifejtett hatását jellemezni tudjuk, és új terápiás lehetőségeknek nyissunk utat.

Irodalom:

1. Blaser MJ. Who are we? Indigenous microbes and the ecology of human diseases. EMBO Rep 2006;7(10):956–60.
2. Dethlefsen L, McFall-Ngai M, Relman D. An ecological and evolutionary perspective on human-microbe mutualism and disease. Nature 2007;449(7164):811–8.
3. Sears CL, Geis AL, Housseau F. Bacteroides fragilis subverts mucosal biology: from symbiont to colon carcinogenesis. J Clin Invest 2014;124(10):4166–72.
4. Cho I, Yamanishi S, Cox L, Methé BA, et al. Antibiotics in early life alter the murine colonic microbiome and adiposity. Nature 2012;488(7413):621–6.
5. Hviid A, Svanstrom H, Frisch M. Antibiotic use and inflammatory bowel diseases in childhood. Gut 2011;60(1):49–54.
6. Wylie KM, Mihindukulasuriya KA, Zhou Y, Sodergren E, et al. Metagenomic analysis of double-stranded DNA viruses in healthy adults. BMC Biol. 2014;10:12–7.
7. Nava, GM, Friedrichsen HJ, Stappenbeck TS. Spatial organization of intestinal microbiota in the mouse ascending colon. ISME J 2011;5:627–38.
8. Pédron T, Mulet C, Dauga C, Frangeul L, et al. A crypt-specific core microbiota resides in the mouse colon. mBio 2012;3:e00116-12. DOI: 10.1128/mBio.00116-12
9. Gevers D, Kugathasan S, Denson LA, Vázquez-Baeza Y, et al. The treatment-naive microbiome in new-onset Crohn’s disease. Cell Host & Microbe 2014;15:382–92.
10. Wallace BD, Wang H, Lane KT, Scott JE, et al. Alleviating cancer drug toxicity by inhibiting a bacterial enzyme. Science 2010;330(6005):831–5.
11. Bravo JA, Forsythe P, Chew MV, Escaravage E, et al. Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve. Proc Natl Acad Sci USA 2011;108(38):16050–5.