Az onkohematológiai diagnosztika újdonságai

Precíziós medicina és az újgenerációs szekvenálás szerepe 

A precíziós medicina egyike az orvostudomány legnagyobb paradigmaváltásainak. Bár alkalmazása az orvostudomány legtöbb területére kiterjeszthető, a szemlélet elsősorban az onkológia és a hematológia terén hozott forradalmi újítást. A precíziós medicinát megelőzően a betegek egységes kezelésben részesültek, a különböző páciensek genetikai háttere közötti különbségeknek, valamint az intratumorális heterogenitásnak a figyelembevétele nélkül. A molekuláris vizsgálóeljárások robbanásszerű fejlődésének köszönhetően jelentősen felgyorsult az onkohematológiai malignitások genetikai profilalkotása, ezáltal számos új prognosztikus és/vagy prediktív biomarkert, valamint potenciálisan célozható molekuláris célpontot sikerült azonosítani. Mindezen új felfedezések több új, fejlettebb diagnosztikus, prognosztikus és prediktív kritériumrendszer kidolgozását tették lehetővé, akárcsak különböző molekuláris támadáspontú célzott terápiák bevezetését az onkohematológiában. Bár ezen szemléletmód korábban is jelen volt, az NGS megjelenését követően a precíziós medicina alappillérének számító molekuláris patológia exponenciális fejlődésnek indult.

Az NGS legnagyobb előnyei közé tartozik a multigénes tesztelés lehetősége, amely során akár több száz vagy több ezer gén szimultán vizsgálatára is lehetőség nyílik. A technológiát nevezik még nagy áteresztőképességű, illetve masszívan paralell szekvenálásnak is, ugyanis a technológia lényege a különböző DNS- vagy RNS-fragmentumok egymás melletti (paralell) szekvenálása, amely az előző lánctermináción alapuló szekvenálási eljárással összehasonlítva jóval nagyobb teljesítményt biztosít. A szekvenálás a klinikai gyakorlatban a DNS és/vagy RNS polinukleotidok (read-ek) szekvenciáinak meghatározását jelenti. Míg a DNS-szekvenálás célja elsősorban a genomban fellelhető mutációk kimutatása, addig az RNS-szekvenálási vizsgálatok során a vizsgált gének kifejeződéséről (expressziójáról) kapunk információt.

Forrás: Medical Tribune

Az NGS szerepe az onkohematológiában

Az NGS-alapú, ún. génpanelvizsgálatok napjainkban az onkohematológiai kórképek (elsősorban a gyermekkori leukémiák) molekuláris diagnosztikájának kihagyhatatlan elemét képezik. A több gén szimultán vizsgálatának lehetősége, valamint adott gének teljes kódolószekvenciájának gyors és érzékeny vizsgálata új távlatokat nyitott a rutin molekuláris diagnosztikában. Mindennek ellenére, a pontos indikációs terület, a génpanelek mérete, valamint az eredmények pontos klinikai interpretációja jelenleg is forrongó terület az onkohematológiában. A Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet Onkohematológiai központja a legkorszerűbb NGS-alapú technológiákkal rendelkezik. Intézetünkben a hematológiai NGS vizsgálatokat elsősorban a krónikus limfocitás leukémiában (CLL) prognosztikus jelentőséggel bíró TP53 mutáció kimutatására, valamint az akut limfoblasztos leukémia (ALL), továbbá különböző myeloid kórképek molekuláris profilalkotására alkalmazzuk. 

A CLL a nyugati országokban leggyakrabban előforduló leukémia, melynek változatos klinikai lefolyásához igen heterogén genetikai háttér társul. Bár a kórkép a molekuláris eltérések azonosítása nélkül is diagnosztizálható, az új célzott terápiák térnyerésének figyelembevételével a megfelelő prognosztikus és prediktív molekuláris biomarkerek azonosítása a CLL diagnózisának alapvető elemévé vált (1). A TP53 tumorszuppresszor gén teljes kódolórégiójának vizsgálata remekül példázza az NGS jelentőségét a precíziós onkohematológiában. A génben azonosított mutációk kedvezőtlen prognózisa régóta ismert, ugyanakkor az új célzott terápiák megjelenésével a biomarker prediktív jelentőségűvé vált. Intézetünkben 2018 óta a TP53 mutáció analízisét a Sanger-szekvenálásnál (20%-os szenzitivitás) jóval érzékenyebb NGS-alapú technológiával vizsgáljuk, amely lehetővé teszi az akár 1%-ban is jelen lévő szubklónok detektálását. Bár a 10% variáns allélfrekvencia (VAF) alatti, ún. szubklonális eltérések, klinikai jelentősége egyelőre vitatott, a 10−20% közötti VAF-al rendelkező klónok kimutatása igen nagy jelentőséggel bír (2, 3). Laboratóriumunk 2018 óta a European Research Initiative on CLL (ERIC) nemzetközi szervezet által akkreditált, ezáltal a TP53 mutáció analízisét évente jelentős mintaszámon végezzük.

Számos hematológiai malignitáshoz hasonlóan az elmúlt években az NGS térnyerése jelentősen bővítette ismereteinket a gyermekkori akut leukémiák változatos genetikai hátterét illetően, a genom és transzkriptom szintjén egyaránt (4, 5). Magyarországon évente mintegy 70−80 új gyermekkori akut leukémiát diagnosztizálnak, melyek kb. 80%-a akut limfoblasztos leukémia (ALL), 15%-a akut myeloid leukémia (AML), míg a maradék 5%-ban krónikus myeloid leukémia (CML), valamint juvenilis myelomonocitás leukémia (JMML) fordulhat elő (6). Bár a komplex, citosztatikumalapú megközelítés az ALL-es esetek közel 90%-ában teljes gyógyulást eredményez, a terápiás szempontból jelentős kihívást jelentő terápiarefrakter és relabált betegek esetében, valamint a gyermekkori AML kezelésében egyre fontosabb szerepet töltenek be a modern, célzott terápiák. 

Az optimális terápia megválasztásához elengedhetetlen a személyre szabott, átfogó és részletes molekuláris profilalkotás, mely a különféle gyermekkori leukémiára specifikus, korszerű NGS-panelek bevezetésével ma már a rutindiagnosztika részévé vált. A különböző betegségekben számos visszatérő molekuláris eltérés azonosítható (AML esetén pl. CEBPA, NPM1, FLT3, IDH1/2, RUNX1, ASXL1 stb.), melyek eltérő genetikai alcsoportokat határoznak meg (7). A genetikai alcsoportokat definiáló eltérések igen gyakran prognosztikus vagy akár prediktív értékkel is bírnak, így meghatározásuk a genetikai szubtípuson felül a különböző rizikócsoportokba történő besorolást is lehetővé teszi. Példaképp megemlíthető a biallélikus CEBPA mutáció AML-ben, amely amellett, hogy önmagában meghatároz egy genetikai alcsoportot, kedvező prognózissal is társul. A génpanel-vizsgálatok jelentőségét, valamint a genetikai alcsoportokra történő felosztás klinikai relevanciáját jól példázza a BCR/ABL1-szerű (Ph-like) ALL. Bár a Ph-like ALL jellemzően egy konvencionális kemoterápiával nehezen kezelhető entitás, a molekuláris eltérések alapján felosztott alcsoportok mindegyike kedvezően reagálhat valamely célzott kezelésre. Például a JAK2, EPOR, PAX5 gének eltérései alapján meghatározott JAK2/EPOR alcsoport kedvezően reagálhat JAK2-inhibitor-kezelésre, míg az ABL alcsoport (ABL1, ABL2, CSFR1, PDGFRA, PDGFRB) esetén a tirozin kináz inhibitor dasatinib alkalmazása járhat klinikai haszonnal. Bár jelen indikáció szerint a célzott kezelések csupán „off label” igényelhetőek, az NGS rutindiagnosztikában történő térnyerésével remélhetőleg hamarosan minden beteg számára elérhetővé válnak a klasszifikációhoz szükséges molekuláris vizsgálóeljárások és ezáltal a célzott kezelés lehetősége. Intézetünk a Magyar Gyermekleukémia Genomikai Profilozás Program keretén belül, Magyarországon elsőként vezette be az NGS panelvizsgálatokat a gyermekkori leukémiák rutindiagnosztikájában. Munkacsoportunk jelenleg egy 59 gént tartalmazó „myeloid” és egy 102 gént tartalmazó „lymphoid” (adott gén teljes kódolószekvenciáját vagy mutációs hotspotokat tartalmazó) DNS-alapú panelt alkalmaz, amelyek a gyermekkori akut leukémiák (ALL, AML, JMML, CML) mellett egyéb myeloid kórképek molekulárisprofil-alkotására is alkalmasak. Ezen felül, a gyermekkori leukémiák transzkriptomikai profilozására laboratóriumunkban egy 1385 gént tartalmazó RNS-alapú (Pancancer) panelt alkalmazunk. Intézetünk kiemelt figyelmet fordít a gyermekkori akut leukémiák molekulárisprofil-alkotására, így ma már Magyarországon is elérhetőek azok a vizsgálatok, melyek nélkülözhetetlenek a betegek innovatív, személyre szabott kezeléséhez.

Egy új potenciális alkalmazási terület: a mérhető reziduális betegség

Az elmúlt években az új, célzott kezelések megjelenése lehetővé tette a tumorsejtek drasztikus és tartós csökkenését, ezáltal a mérhető reziduális betegség (régebbi nevén minimális reziduális betegség, MRD) több hematológiai entitásban is kiemelt szerepet kapott. Míg akut limfoblasztos leukémiában az MRD meghatározása a rizikóbesorolás/terápiás döntéshozatal része, szerepe több hematológiai malignitás esetén, így például CLL-ben is egyelőre bizonytalan. Az MRD meghatározására jelenleg a konvencionális flow citometria, valamint PCR-alapú módszerek mellett több NGS-alapú eljárás is alkalmazható (8). Bár az NGS-alapú MRD-követés jelenleg kevésbé elterjedt, az elmúlt évek vizsgálatainak eredményei igen biztatóak, így az NGS-alapú MRD-monitorozás egy új, potenciális rutindiagnosztikai eljárás lehet a jövőben.

Összefoglalás

Az új generációs szekvenálás megjelenése és térnyerése minden kétséget kizáróan egy új fejezetet nyitott a precíziós onkohematológiában. Az új, innovatív, személyre szabott célzott terápiák alkalmazásának feltétele a beteg minél pontosabb molekulárisprofil-alkotása, melyben az új generációs szekvenálás ma már megkerülhetetlen. Bár az NGS onkohematológiában történő alkalmazása jelenleg elsősorban a különböző hematológiai entitásokra specifikus génpanelvizsgálatokat jelenti, az elmúlt években számos új ígéretes alkalmazási terület jelent meg. Kutatócsoportunk kiemelt figyelmet fordít az új NGS-alapú vizsgálatok rutindiagnosztikába történő beépítésére, így ma már Magyarországon is elérhetőek azok az innovatív vizsgálatok, melyek nélkülözhetetlenek az onkohematológiai betegek korszerű ellátásához. Örömteli fejlemény, hogy az NGS vizsgálatok többsége a Magyar Hematológiai és Transzfuziológiai Társaság Molekuláris Munkacsoportjának további laboratóriumaiban (Debreceni Egyetem, Dél-pesti Centrumkórház – Országos Hematológiai és Infektológiai Intézet, Pécsi Tudományegyetem, Szegedi Tudományegyetem) is elérhetővé vált.

IRODALOM

1.    Hallek M, et al. iwCLL guidelines for diagnosis, indications for treatment, response assessment, and supportive management of CLL. Blood 2018;131(25):2745−2760.

2.    Bomben R, et al. TP53 Mutations with Low Variant Allele Frequency Predict Short Survival in Chronic Lymphocytic Leukemia. Clin Cancer Res 2021;27(20):5566−5575.

3.    Malcikova J, et al. ERIC recommendations for TP53 mutation analysis in chronic lymphocytic leukemia—update on methodological approaches and results interpretation. Leukemia 2018;32(5):1070−1080.

4.    Bolouri H, et al. The molecular landscape of pediatric acute myeloid leukemia reveals recurrent structural alterations and age-specific mutational interactions. Nat Med 2018;24(1):103−112.

5.    Coccaro N, et al. Next-Generation Sequencing in Acute Lymphoblastic Leukemia. Int J Mol Sci 2019;20(12):2929.

6.    Garami M, Schuler D,  Jakab Z. Importance of the National Childhood Cancer Registry in the field of paediatric oncology care. Orvosi Hetilap 2014;155(19):732−739.

7.    Arber DA, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016;127(20):2391−2405.

8.    Wierda WG, et al. Measurable residual disease in chronic lymphocytic leukemia: expert review and consensus recommendations. Leukemia 2021;35(11):3059−3072.